单细胞 RNA-seq 质量控制：技能亮点

单细胞 RNA-seq 质量控制：技能亮点

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技能练习生
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为什么说"QC 决定了你研究的上限"

1.1 单细胞 QC 的独特挑战

挑战一：细胞质量差异极大

与传统 bulk RNA-seq 不同，单细胞数据的细胞质量呈现极端异质性：

数据示例（来自真实 PBMC 数据集）：

  • 高质量 T 细胞：检测到 2500 个基因，线粒体基因比例 3%
  • 低质量/垂死细胞：仅检测到 200 个基因，线粒体基因比例 35%
  • 空液滴（空 droplet）：检测到 50 个基因，线粒体基因比例 80%

如果不进行 QC：

  • 低质量细胞会形成独立的"垃圾簇"，干扰聚类分析
  • 高线粒体比例的细胞会掩盖真实的生物学差异
  • 浪费计算资源分析无效数据

挑战二：固定阈值不适用于所有场景

常见误区：直接套用文献中的固定阈值（如 mt < 5%）

为什么这是错的？

不同组织/细胞类型的线粒体含量差异巨大：

组织类型正常线粒体比例是否需要过滤
免疫细胞（PBMC）3-8%>10% 需过滤
心肌细胞15-25%>30% 才需过滤
肝细胞8-15%>20% 需过滤
肿瘤细胞5-20%视具体类型而定

结论：必须基于数据本身的分布选择阈值，而非使用固定值。

挑战三：过度过滤与过滤不足的平衡

过度过滤的风险：

  • 丢失稀有细胞群（如干细胞、特定亚群）
  • 引入选择偏差，影响下游分析
  • 低转录量细胞（如静息细胞）被误删

过滤不足的风险：

  • 聚类结果混乱
  • 差异表达分析不可靠
  • 细胞类型注释错误

关键：采用保守的过滤策略（permissive filtering），宁可保留一些噪音，也不丢失真实信号。

1.2 QC 的三大核心维度

维度一：测序深度与基因检出

指标：

  • n_counts：每细胞检测到的 UMI 总数（测序深度）
  • n_genes：每细胞检测到的基因数（基因检出数）

生物学意义：

  • 高质量细胞：高 n_counts + 高 n_genes
  • 低质量细胞：低 n_counts + 低 n_genes（可能是破碎细胞）
  • 双细胞（doublet）：异常高的 n_counts + n_genes（两个细胞被误认为一个）

典型分布：

高质量 PBMC 数据：
  - n_counts: 中位数 5,000-10,000
  - n_genes: 中位数 1,500-2,500

可视化示例：

期望分布（单峰，略右偏）：
│        ╱╲
│       ╱  ╲
│      ╱    ╲_____╱
│_____╱          ╲___│
    低        高    异常高
             质量区   双细胞

维度二：细胞活性与状态

指标：

  • pct_counts_mt：线粒体基因 UMI 占比
  • pct_counts_ribo：核糖体基因 UMI 占比
  • pct_counts_hb：血红蛋白基因 UMI 占比（针对血液样本）

生物学意义：

指标高比例低比例
线粒体细胞死亡/应激/破损健康细胞
核糖体高代谢活性（增殖细胞）静息/分化细胞
血红蛋白红细胞污染（血液样本）正常（非血液样本）

线粒体基因的判断标准：

  • 人类：基因名以 MT- 开头（如 MT-CO1）
  • 小鼠：基因名以 mt- 开头（如 mt-Co1）
  • 其他物种：需查阅对应的前缀规则

特殊案例：

  • 心肌细胞：正常线粒体比例 15-25%（能量需求高）
  • 增殖细胞：核糖体比例高（蛋白质合成活跃）

维度三：技术伪影识别

常见技术问题：

  1. 空液滴（Empty Droplets）

    • 特征：极低的 n_counts 和 n_genes
    • 原因：无细胞的液滴被错误捕获
    • 处理：使用 EmptyDrops 算法或简单阈值过滤

  2. 双细胞（Doublets）

    • 特征：异常高的 n_counts 和 n_genes
    • 原因：两个细胞被封装在同一个液滴
    • 处理：使用 Scrublet 或 DoubletFinder 检测

  3. 环境 RNA（Ambient RNA）

    • 特征：低质量细胞中高表达管家基因
    • 原因：细胞破裂释放 RNA 被其他细胞捕获
    • 处理：使用 SoupX 或 CellBender 纠正

  4. 细胞周期干扰

    • 特征：聚类主要由细胞周期驱动
    • 原因：细胞周期基因高度表达掩盖其他差异
    • 处理：回归或使用 scVI 等方法校正

1.3 MAD 方法的优势

什么是 MAD？

MAD（Median Absolute Deviation，中位数绝对偏差） 是一种鲁棒的统计量，用于衡量数据的离散程度：

MAD = median(|xi - median(x)|)

计算示例：

数据：[1, 2, 2, 3, 3, 4, 100]  # 100 是异常值
中位数：3
MAD = median([2, 1, 1, 0, 0, 1, 97]) = 1

# 与标准差对比：
标准差 = 37.5  # 被异常值拉大
MAD = 1        # 不受异常值影响

MAD 过滤策略

核心思想：将偏离中位数超过 n 个 MAD 的细胞视为异常值

# 计算阈值
median = np.median(data)
mad = np.median(np.abs(data - median))
lower_threshold = median - n_mads * mad
upper_threshold = median + n_mads * mad

# 过滤
valid_cells = (data > lower_threshold) & (data < upper_threshold)

推荐参数：

  • n_mads = 3：宽松过滤，保留更多细胞（本教程推荐）
  • n_mads = 5：极宽松过滤，适用于数据量少或稀有细胞群
  • n_mads = 2：严格过滤，适用于高置信度数据

优势对比：

方法自适应性鲁棒性过滤强度推荐场景
固定阈值（mt < 5%）❌❌未知❌ 不推荐
Z-score 方法✅❌（受异常值影响）适中⚠️ 可用
MAD 方法✅✅保守（permissive）✅ 强烈推荐
百分位数（5%-95%）✅⚠️过严⚠️ 小数据集

实际案例：

数据集 A（高质量 PBMC，10K 细胞）：
  - 固定阈值（mt < 5%）：保留 8,500 细胞（丢失 15%）
  - MAD（n_mads=3）：保留 9,200 细胞（丢失 8%）

数据集 B（低质量肿瘤，5K 细胞）：
  - 固定阈值（mt < 5%）：保留 1,200 细胞（丢失 76%！）
  - MAD（n_mads=3）：保留 3,800 细胞（丢失 24%）

结论：MAD 方法在各种数据集上表现稳定，是首选策略。

1.4 QC 流程全景图

输入数据（.h5ad / .h5）
    ↓
┌───────────────────────┐
│ 1. 计算 QC 指标        │
│  - n_counts, n_genes   │
│  - mt%, ribo%, hb%     │
└───────────────────────┘
    ↓
┌───────────────────────┐
│ 2. 可视化数据分布      │
│  - 小提琴图            │
│  - 散点图              │
│  - 直方图              │
└───────────────────────┘
    ↓
┌───────────────────────┐
│ 3. 识别异常值（MAD）   │
│  - 自动计算阈值        │
│  - 生成过滤 mask       │
└───────────────────────┘
    ↓
┌───────────────────────┐
│ 4. 应用过滤            │
│  - 过滤细胞            │
│  - 过滤低表达基因      │
└───────────────────────┘
    ↓
┌───────────────────────┐
│ 5. 验证结果            │
│  - 检查过滤后分布      │
│  - 确保合理保留率      │
└───────────────────────┘
    ↓
输出高质量数据（ready for downstream analysis）

1.5 常见误区与最佳实践

❌ 误区 1：过滤越严格越好

错误观念：认为应该尽可能多地过滤"可疑"细胞

问题：

  • 稀有细胞群（频率 < 5%）可能被误删
  • 静息细胞（低转录活性）被误认为低质量
  • 数据量损失过多，影响统计功效

正确做法：

  • 使用保守的阈值（n_mads = 3 或 5）
  • 保留率建议 > 70%
  • 检查是否丢失已知细胞类型

❌ 误区 2：套用文献中的固定阈值

错误观念：直接使用论文中报告的 QC 阈值

问题：

  • 不同组织/物种的基线不同
  • 不同平台（10X v2 vs v3）的分布不同
  • 实验条件影响数据质量

正确做法：

  • 基于数据分布选择阈值
  • 使用 MAD 等自适应方法
  • 参考文献但不盲从

❌ 误区 3：忽略基因层面的过滤

错误观念：只过滤细胞，不过滤基因

问题：

  • 低表达基因增加噪音和计算负担
  • 影响 HVG 选择和降维

正确做法：

  • 过滤在 < 10-20 个细胞中表达的基因
  • 或使用更宽松阈值（< 3 个细胞）保留稀有转录本

✅ 最佳实践清单

  1. 数据驱动：基于数据分布选择阈值，而非固定值
  2. 保守过滤：宁可保留一些噪音，不丢失真实信号
  3. 可视化检查：每次过滤后检查 QC 指标分布
  4. 迭代优化：首次过滤后，根据结果调整参数
  5. 记录决策：记录使用的阈值和理由，便于重现
  6. 领域知识：结合特定组织/细胞类型的生物学特性

1.6 QC 的时间投入

典型时间投入（10K 细胞数据集）：

步骤手动分析自动化脚本
数据加载1 分钟< 1 秒
计算 QC 指标2 分钟< 1 秒
可视化检查5 分钟自动生成
确定阈值10-15 分钟自动（MAD）
应用过滤1 分钟< 1 秒
总计20-25 分钟< 2 分钟

投资回报率：

  • 前期投入：学习和编写 QC 脚本（2-3 小时）
  • 长期收益：每次分析节省 15-20 分钟，避免重复劳动
  • 质量提升：减少下游分析问题的 80%+

下一章

现在你已经理解了单细胞 QC 的核心价值和方法论，是否迫不及待想要实践？

在第二章中，我们将通过一个完整的实战案例，带你亲身体验从数据加载到质控过滤的全流程。即使你没有任何编程基础，也能在 20 分钟内完成第一次单细胞 QC。

→ 继续阅读：第二章 - 快速入门

下一部分单细胞 RNA-seq 质量控制：快速入门